آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم – سری ۲

آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم – سری۲ دکتر حمیدرضا گلی

پیشروی کرد.و یا در زمینه ژنتیک سلولی آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم برای مثال بسیاری از بیماریهای کروموزومی انسانی ، هم اکنون نه تنها در دوارن بعد از تولد از طریق کشت سلولهای مغز استخوان قابل تشخیص است، بلکه از ماههای ابتدایی نمو رویانی نیز با کشت سلولهای مایع آمنیونی شناخته می‌شود.

در حال حاضر با به‌کارگیری زیست‌شناسی مولکولی یا روش‌ها و ابزارهای آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم زیست‌شناسی سلولی مولکولی در پزشکی به عنوان پزشکی مولکولی شناخته می‌شود و زیست‌شناسی مولکولی نقش مهمی در درک شکل‌گیری، فعالیت و تنظیم بخش‌های مختلف یک سلول ایفا می‌کند که می‌تواند برای تعیین دقیق اهداف داروهای جدید، تشخیص آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم بیماری‌ها و درک فیزیولوژی سلول مورد استفاده قرار گیرد.

پس شناخت ابزار ها و روش های جدید موجب گسترش علوم سلولی مولکولی شد و می توان برای آینده ای نه چندان دور پیش بینی آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم های زیر را در زمینه علوم سلولی و مولکولی بیان نمود:

۱٫شناخت کامل سازمان مولکولی سلول و فرایندهای زیستی وابسته به آن.

۲٫فراهم آوردن امکانات انجام پدیده‌های پیچیده زیستی، از جمله سنتز انواع مختلف پروتئین ها،آنزیم ها،اسیدهای هسته‌ای و ماکرومولکول‌های دیگر در شرایط آزمایشگاهی.

۳٫تغییرات انتخابی در کد ژنتیکی و از آن طریق کاستن و حتی از میان بردن نواقص و بیماریهای ژنتیکی در انسان ، جانور و گیاه.امکان تعیین و تغییر جنسیت جنین قبل از تولد.

۴٫ایجاد جنسها و گونه‌های جدید جانداران با تغییر در کدهای ژنتیکی.

علم بررسی اعمال زیستی سلولها و اجزا مختلف آنهاست. عمده‌ترین مسائل مورد توجه در این علم ، مطالعه ماهیت غشای سلولی ، تغذیه سلول ، رشد و نمو ، آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم ترشح و سایر فعالیتهای سلولی است.

ژنتیک سلولی:

با استفاده از روشهای سلول شناس آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم

ی و ژنتیک ، از توارث و تنوع سلولها ، بحث می‌کند. این علم به مطالعه ماده ژنتیکی سلولها و بویژه کروموزومها از نظر تعداد و شکل در سلولهای گونه‌های مختلف می‌پردازد.

شیمی سلولی:

با استفاده از ابزارها و فنون شیمیایی ویژه ، با حداقل تغییرات ممکن ، ترکیبات شیمیایی سلولها و جای آنها را بررسی می‌نماید. چنین مطالعاتی هم اکنون در آسیب شناسی (Pathology) نیز مورد استفاده است.

زیست شناسی مولکولی به بررسی مولکول‌های سازنده سلول بویژه ماکرومولکولها از نظر نوع و ساختمان ، ریخت ، تکامل ، گسترش و نقش آنها در پدیده‌های زیستی سلول می‌پردازد. بیوشیمی ماکرومولکولها و ژنتیک مولکولی از مباحث مورد توجه این شاخه است.

۵٫افزایش ظرفیت مغزی انسان و جانوران به منظور گسترش انوع حس ، حافظه و سازگاری یا مقابله با محیط زیست.

۶٫بوجود آوردن ایمنی کامل در انواع جانداران در برابر بیماریها در طول حیات.

ترنسفورمیشن مرحله ای از مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن است که در آن یک ژن خارجی را به یک سلول منتقل میکنیم. ترنسفورمیشن یک پلازمید نوترکیب به یک باکتری، هم برای ذخیره آن ژن و هم برای تولید آن ژن بکار میرود. به همین دلیل علاوه بر پلاسمیدهایی که برای ژن به باکتری منتقل میشوند، پلاسمیدهایی که برای بیان در سلولهای پستانداران تهیه شده اند، حامل توالی مبدا همانندسازی باکتری و یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک برای انتخاب کلونی باکتری نیز هستند.

دانشمندان سویه های آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم از باکتری های ایجاد کرده اند که راحت تر ترنسفورم شوند و پلاسمید را برای مدت طولانی بدون تغییر در خود نگه دارند. برخی شرکت ها سلول های آماده ترنسفورم را بصورت فریز می فروشند؛ شرکت پویاژن آزما نیز بر آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم درخواست شما عزیزان سلول مستعد آماده ترنسفورم را برای شما ارسال میکند.

وسایل موردنیاز برای ترنسفورمیشن

انکوباتور شیکردار (۳۷درجه سانتی گراد)

انکوباتور معمولی (۳۷ درجه سانتی گراد)

بن ماری (۴۲ درجه آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسمگراد)

بشر یا یک ظرف پر از یخ

میکروتیوب

وسایل استریل (سر سمپلر و میکروتیوب و وسایل کشت باکتری)

مواد موردنیاز برای ترنسفورمیشن

پلیت موردنیاز LB آگار (حاوی آنتی بیوتیکی که پلاسمید شما ژن آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم به آن را دارد.)

محیط کشت LB مایع

پلازمید و DNA موردنظر

سلولهای میزبان

ابتدا یک یا دو کلنی از باکتری را درون ۵ میلی لیتر محیط کشت LB مایع کشت داده و اجازه دهید درون انکوباتور شیکردار در ۳۷ درجه سانتی گراد رشد کنند تا کدورت رشد باکتریها به ۲/۰ تا ۶/۰ = _۶۰۰OD برسد (معمولا ۳-۴ ساعت).

میکروتیوب ها را درون آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم قرار دهید تا هنگام استفاده سرد باشند. آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم به مقدار کافی رشد کردند در هر میکروتیوب یک میلی لیتر از سلولها را بریزید و سانتریفیوژ کنید.

رسوب را در ۱ میلی لیتر CaCl_۲ سرد استریل حل کرده ۳۰ دقیقه روی یخ قرار دهید و سپس سانتریفیوژ کنید.

محلول رویی را دور ریخته و در هر میکروتیوب ۲۰۰ میکرولیتر CaCl_۲ سرد استریل اضافه کنید.

در این روش با استفاده از یون های کلسیم، سلولهای مستعد (cell competent) ایجاد میشود. به این صورت که با افزودن کلسیم کلرید به سلولها، به دلیل مثبت بودن یون کلسیم و منفی بودن بار غشاء، یون کلسیم در اطراف غشاء قرار گرفته و باعث جذب پلاسمید که بار منفی دارد میشود. همچنین یون کلسیم تولید PABA (پلی آمینو بوتریک اسید) را القا کرده که باعث افزایش کانالهای سطح غشاء میشود. که روش استفاده از این ماده برای ترنسفورمیشن را در تهیه سلولهای مستعد توضیح دادیم.

اما برای بهبود این روش و اثر بخشی آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم آن، از شوک دمایی بصورت زیر استفاده میکنیم:

• سلول هایی که در مرحله قبل تهیه کردید را از یخچال خارج کنید. به ۵۰ میکرولیتر از سلول ها ۰/۲۵ نانوگرم از پلاسمید (حدود ۲/۵ میکرولیتر) افزوده و روی یخ قرار دهید.
• ۳۰ دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
• ۹۰ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتی گراد قرار دهید تا شوک دمایی به آن وارد شود.
• ۱ دقیقه روی یخ قرار دهید.
• ۱میکرولیر از محیط LB مایع به آن افزوده و به مدت ۴۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
• ۱۰۰ میکرولیتر از آن را روی محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک کشت دهید.

روش دیگر ترنسفورمیشن

کلونی هایی که در این محیط رشدکنند حامل پلاسمید آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم . اما آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسماست در مرحله لایگیشن ژن موردنظر ما درون پلاسمید نبوده و پلاسمید به انتهای خودش متصل شده باشد اما به دلیل وجود ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در این محیط رشد میکند. برای انتخاب کلونی های حاوی ژن موردنظر، روش های متنوعی وجود دارد که در مقاله بعدی خواهیم گفت.

پیشروی کرد.و یا در زمینه ژنتیک سلولی برای مثال بسیاری از بیماریهای کروموزومی انسانی ، هم آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم نه تنها در دوارن بعد از تولد از طریق کشت سلولهای مغز استخوان قابل تشخیص است، بلکه از ماههای ابتدایی نمو رویانی نیز با کشت سلولهای مایع آمنیونی شناخته می‌شود.

در حال حاضر با به‌کارگیری زیست‌شناسی مولکولی یا روش‌ها و آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسم زیست‌شناسی سلولی مولکولی در پزشکی به عنوان پزشکی مولکولی شناخته می‌شود و زیست‌شناسی مولکولی نقش مهمی در درک شکل‌گیری، فعالیت و تنظیم بخش‌های مختلف یک سلول ایفا می‌کند که می‌تواند برای تعیین دقیق اهداف داروهای جدید، تشخیص بیماری‌ها و درک فیزیولوژی سلول مورد استفاده قرار گیرد.

پس شناخت ابزار ها و روش های جدید موجب گسترش علوم سلولی مولکولی شد و می توان برای آینده ای نه چندان دور پیش بینی های زیر را در زمینه علوم سلولی و مولکولی بیان نمود:

۱٫شناخت کامل سازمان مولکولی سلول و فرایندهای زیستی وابسته به آن.

۲٫فراهم آوردن امکانات انجام پدیده‌های پیچیده زیستی، از جمله سنتز انواع مختلف آموزش ژنتیک میکرو ارگانیسمها،آنزیم ها،اسیدهای هسته‌ای و ماکرومولکول‌های دیگر در شرایط آزمایشگاهی.

۳٫تغییرات انتخابی در کد ژنتیکی و از آن طریق کاستن و حتی از میان بردن نواقص و بیماریهای ژنتیکی در انسان ، جانور و گیاه.امکان تعیین و تغییر جنسیت جنین قبل از تولد.

۴٫ایجاد جنسها و گونه‌های جدید جانداران با تغییر در کدهای ژنتیکی.

علم بررسی اعمال زیستی سلولها و اجزا مختلف آنهاست. عمده‌ترین مسائل مورد توجه در این علم ، مطالعه ماهیت غشای سلولی ، تغذیه سلول ، رشد و نمو ، ترشح و سایر فعالیتهای سلولی است.

ژنتیک سلولی:

با استفاده از روشهای سلول شناس

ی و ژنتیک ، از توارث و تنوع سلولها ، بحث می‌کند. این علم به مطالعه ماده ژنتیکی سلولها و بویژه کروموزومها از نظر تعداد و شکل در سلولهای گونه‌های مختلف می‌پردازد.

شیمی سلولی:

با استفاده از ابزارها و فنون شیمیایی ویژه ، با حداقل تغییرات ممکن ، ترکیبات شیمیایی سلولها و جای آنها را بررسی می‌نماید. چنین مطالعاتی هم اکنون در آسیب شناسی (Pathology) نیز مورد استفاده است.

زیست شناسی مولکولی به بررسی مولکول‌های سازنده سلول بویژه ماکرومولکولها از نظر نوع و ساختمان ، ریخت ، تکامل ، گسترش و نقش آنها در پدیده‌های زیستی سلول می‌پردازد. بیوشیمی ماکرومولکولها و ژنتیک مولکولی از مباحث مورد توجه این شاخه است.

۵٫افزایش ظرفیت مغزی انسان و جانوران به منظور گسترش انوع حس ، حافظه و سازگاری یا مقابله با محیط زیست.

۶٫بوجود آوردن ایمنی کامل در انواع جانداران در برابر بیماریها در طول حیات.

ترنسفورمیشن مرحله ای از مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن است که در آن یک ژن خارجی را به یک سلول منتقل میکنیم. ترنسفورمیشن یک پلازمید نوترکیب به یک باکتری، هم برای ذخیره آن ژن و هم برای تولید آن ژن بکار میرود. به همین دلیل علاوه بر پلاسمیدهایی که برای ژن به باکتری منتقل میشوند، پلاسمیدهایی که برای بیان در سلولهای پستانداران تهیه شده اند، حامل توالی مبدا همانندسازی باکتری و یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک برای انتخاب کلونی باکتری نیز هستند.

دانشمندان سویه های متنوعی از باکتری های ایجاد کرده اند که راحت تر ترنسفورم شوند و پلاسمید را برای مدت طولانی بدون تغییر در خود نگه دارند. برخی شرکت ها سلول های آماده ترنسفورم را بصورت فریز می فروشند؛ شرکت پویاژن آزما نیز بر اساس درخواست شما عزیزان سلول مستعد آماده ترنسفورم را برای شما ارسال میکند.

وسایل موردنیاز برای ترنسفورمیشن

انکوباتور شیکردار (۳۷درجه سانتی گراد)

انکوباتور معمولی (۳۷ درجه سانتی گراد)

بن ماری (۴۲ درجه سانتی گراد)

بشر یا یک ظرف پر از یخ

میکروتیوب

وسایل استریل (سر سمپلر و میکروتیوب و وسایل کشت باکتری)

مواد موردنیاز برای ترنسفورمیشن

پلیت موردنیاز LB آگار (حاوی آنتی بیوتیکی که پلاسمید شما ژن مقاومت به آن را دارد.)

محیط کشت LB مایع

پلازمید و DNA موردنظر

سلولهای میزبان

مراحل تهیه سلول های مستعد

ابتدا یک یا دو کلنی از باکتری را درون ۵ میلی لیتر محیط کشت LB مایع کشت داده و اجازه دهید درون انکوباتور شیکردار در ۳۷ درجه سانتی گراد رشد کنند تا کدورت رشد باکتریها به ۲/۰ تا ۶/۰ = _۶۰۰OD برسد (معمولا ۳-۴ ساعت).

میکروتیوب ها را درون فریزر قرار دهید تا هنگام استفاده سرد باشند. هنگامیکه به مقدار کافی رشد کردند در هر میکروتیوب یک میلی لیتر از سلولها را بریزید و سانتریفیوژ کنید.

رسوب را در ۱ میلی لیتر CaCl_۲ سرد استریل حل کرده ۳۰ دقیقه روی یخ قرار دهید و سپس سانتریفیوژ کنید.

محلول رویی را دور ریخته و در هر میکروتیوب ۲۰۰ میکرولیتر CaCl_۲ سرد استریل اضافه کنید.

در این روش با استفاده از یون های کلسیم، سلولهای مستعد (cell competent) ایجاد میشود. به این صورت که با افزودن کلسیم کلرید به سلولها، به دلیل مثبت بودن یون کلسیم و منفی بودن بار غشاء، یون کلسیم در اطراف غشاء قرار گرفته و باعث جذب پلاسمید که بار منفی دارد میشود. همچنین یون کلسیم تولید PABA (پلی آمینو بوتریک اسید) را القا کرده که باعث افزایش کانالهای سطح غشاء میشود. که روش استفاده از این ماده برای ترنسفورمیشن را در تهیه سلولهای مستعد توضیح دادیم.

اما برای بهبود این روش و اثر بخشی بهتر آن، از شوک دمایی بصورت زیر استفاده میکنیم:

• سلول هایی که در مرحله قبل تهیه کردید را از یخچال خارج کنید. به ۵۰ میکرولیتر از سلول ها ۰/۲۵ نانوگرم از پلاسمید (حدود ۲/۵ میکرولیتر) افزوده و روی یخ قرار دهید.
• ۳۰ دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
• ۹۰ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتی گراد قرار دهید تا شوک دمایی به آن وارد شود.
• ۱ دقیقه روی یخ قرار دهید.
• ۱میکرولیر از محیط LB مایع به آن افزوده و به مدت ۴۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
• ۱۰۰ میکرولیتر از آن را روی محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک کشت دهید.

روش دیگر ترنسفورمیشن

کلونی هایی که در این محیط رشدکنند حامل پلاسمید هستند. اما ممکن است در مرحله لایگیشن ژن موردنظر ما درون پلاسمید نبوده و پلاسمید به انتهای خودش متصل شده باشد اما به دلیل وجود ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در این محیط رشد میکند. برای انتخاب کلونی های حاوی ژن موردنظر، روش های متنوعی وجود دارد که در مقاله بعدی خواهیم گفت.

برای رسیدن به بهترین حالت ۲۴ ساعت درون یخچال قرار دهید. در طول ۲۴ ساعت سلولها بطور افزایشی برای ترنسفورم بهتر شده و بعد از آن عملکردشان کاهش یافته و پس از یک هفته به حداقل عملکرد خود میرسد.

برای رسیدن به بهترین حالت ۲۴ ساعت درون یخچال قرار دهید. در طول ۲۴ ساعت سلولها بطور افزایشی برای ترنسفورم بهتر شده و بعد از آن عملکردشان کاهش یافته و پس از یک هفته به حداقل عملکرد خود میرسد.