دانلود پی دی اف ( pdf ) جزوه اصول PCR د.ع.پ.ایران

دانلود پی دی اف ( pdf ) جزوه اصول PCR د.ع.پ.ایران

داتلود جزوه اصول PCR

در گذشته برای تولید قطعات نوکلئوتیدی معمولا از روش های شیمیایی استفاده می‌کردند و یا برای بدست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص، این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر می نمودند. این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند. تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reacti ) به منظور تکثیر یک قطعه DNA در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) کارمند شرکت Cetus ارائه شده است.

PCR  مزایای بسیاری داشت (از جمله بررسی یک روزه نمونه ها، ارزان بودن نسبی، آسانی انجام و فوق العاده اختصاصی بودن) و انقلابی در تشخیص کلینیکی بیماری ها، پزشکی، علوم جنایی و پلیسی، میکروبیولوژی و بسیاری صنایع ایجاد کرد. این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد و امروزه تقریباً در تمامی آزمایشگاههای زیست مولکولی جزو کارهای متداول بوده و به صورت اتوماتیک بوسیله ی کامپیوتر انجام می شود. به دلیل همین کشف در سال ۱۹۹۳، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود. با این روش می توان یک ژن را به اندازه ای تکثیر کرد تا بتوان با استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز مشاهده کرد. شما یک تار مو را از فاصله ۶ متری نمی توانید ببینید اما یک دسته میلیاردی از مو کنار هم به خوبی مشاهده می شوند.

اساس این روش بسیار

– مرحله واسرشت (Denaturation step)

این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد. هرچه زمان Ramp (زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد) کمتر باشد نتیجه کار بهتر است و واکنش، زمان کمتری در دمای ناخواس داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR ته قرار می گیرد. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.

۲- مرحله اتصال (Annealing step) 

دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۳۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این دما دو رشته هر مولکول میتوانند دوباره به یکدیگر متصل شوند ولی این اتفاق نمی افتد زیرا مخلوط حاوی مقدار بیشتری مولکول های کوچک DNA به نام پرایمر(Primer) است که معمولا از ۲۵-۱۸ باز آلی تشکیل شده اند و به DNAی تک رشته ای الگو متصل می شوند. دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است.

PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA بر اساس قوانین معروف واتسون- کریک دارد و در واقع برگرفته از آن است. همیشه A با T و G با C جفت می شود. بنابراین پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند و رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

۳- مرحله پلیمریزاسیون یا طویل شدن (Extension/elongation step)

آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر- الگو، با اضافه کردن نـوکـلـئـوتـیـد تـری فـسـفـات‌هـای موجود در محلول بر روی عامل-OH  َ۳ پرایمرها همانند سازی DNA را آغاز کرده و رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد. دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب می شود.

مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز، تعداد بازهای بین دوپرایمر و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود.

۴- ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این ۳ مرحله، چرخه اول تمام می‌شود و چـرخـه ‌های بعدی تکرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد. بار دیگر سیستم گرم می شود و در اینجا هشت نسخه بوجود می آید، و در مرحله

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه داتلود جزوه اصول PCR  برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

ی بعد ۱۶ نسخه و به همین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدی و به نسبتⁿ۲ افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. به طور مثال یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر می شود.

تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نی داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR از انتخاب می شود. لازم به ذکر است که DNA های کوتاه (Short target product) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential) و DNA های بلند (long target product) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می باشند بصورت تصاعد حسابی (linearly) زیاد می شوند.

۵- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (T_m)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

۶- نگهداری نهایی (Final hold)

در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

۷- ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، الکتروفورز نمودن همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) و یا رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید بررسی نمود.

بوده و مانند واکنش همانندس

عمولا اختصاصیت یک پرایمر با تغییر در طول این مولکول، تنظیم می‌شود که به نوبه خود، منجر به تغییر دمای مرحله آنیلینیگ خواهد شد. در بیشتر موارد، پرایمرهایی به طول ۱۸ تا ۲۴ نوکلئوتید، از اختصاصیت بالایی برخوردارند و در این بازه، افزایش هر نوکلئوتید، موجب تقویت ۴ برابری اختصاصیت پرایمر می‌شود. کاهش طول این رشته‌ها به شدت بر توانایی اتصال اختصاصی آن‌ها اثرگذار خواهد بود، به طور‌یکه پرایمرهایی با طول کمتر از ۱۵ نوکلئوتید،‌ عملا به هر نقطه از متصل می‌شوند.

تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction ) به منظور تکثیر یک قطعه DNA در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) کارمند شرکت Cetus ارائه شده است. PCR  مزایای بسیاری داشت (از جمله بررسی یک روزه نمونه ها، ارزان بودن نسبی، آسانی انجام و فوق العاده اختصاصی بود داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR داتلود جزوه اصول PCR ن) و انقلابی در تشخیص کلینیکی بیماری ها، پزشکی، علوم جنایی و پلیسی، میکروبیولوژی و بسیاری صنایع ایجاد کرد. این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد و امروزه تقریباً در تمامی آزمایشگاههای زیست مولکولی جزو کارهای متداول بوده و به صورت اتوماتیک بوسیله ی کامپیوتر انجام می شود. به دلیل همین کشف در سال ۱۹۹۳، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود. با این روش می توان یک ژن را به اندازه ای تکثیر کرد تا بتوان با استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز مشاهده کرد. شما یک تار مو را از فاصله ۶ متری نمی توانید ببینید اما یک دسته میلیاردی از مو کنار هم به خوبی مشاهده می شوند.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA  پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase  به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها استفاده می شود. در این تکنیک ابتدا پرایمراز DNA  موردنظر، طراحی می شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تکثیر کرده و توسط الکتروفورز در مقابل یک کنترل می سنجند.

بافر شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA  الگو (نمونه) کمک می کند. بافر به صورت ۱۰ x ساخته می شود.

۶- کاتیون های دو ظرفیتی(یون های منیزیم یا منگنز) و کاتیون های یک ظرفیتی(یون پتاسیم)

یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA  polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون (عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم(Mgcl۲)) برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است

۷- روغن معدنی  mineral oil

برای جلوگیری از تبخیر محلول در دستگاه چرخش حرارتی و در نتیجه افزایش غلظت در بخش های بالائی محلول، معمولا یک لایه روغن (معمولا ۵۰ تا ۶۰ میکرولیتر به محلول واکنش ۱۰۰ میکرولیتری) بر سطح محلول اضافه می شود. در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده می شود.

۸- ترموسایکلر

دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی) قابل برنامه ریزی برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

۹- ظروف مورد استفاده

میکرو پیپت (برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرولیتر)، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند سمپلر، سر سمپلر، ویال (لوله های درب دار کوچک،

مراحل  PCR

۱- مرحله واسرشت (Denaturation step)

۲- مرحله اتصال (Annealing step)

۳- مرحله پلیمریزاسیون یا طویل شدن (Extension/elongation step)

۴- ادامه PCR بعد از چرخه اول

۵- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

۶- نگهداری نهایی (Final hold)

۷- ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)بررسی نمود.

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای ۱۰ درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

ازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA  پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase  به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها استفاده می شود. در این تکنیک ابتدا پرایمراز DNA  موردنظر، طراحی می شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تکثیر کرده و توسط الکتروفورز در مقابل یک کنترل می سنجند.