آموزش بافت شناسی همبند عملی

هدف از تثبیت این است که بافت‌های نمونه‌برداری شده را از نظر ساختاری حفظ کرد. تثبیت باید در اسرع وقت پس از جداسازی بافت‌ها (از بدن) و یا بلافاصله پس از مرگ (با کالبد شکافی) برای جلوگیری از اتولیز انجام گیرد. تثبیت‌کننده ایده‌آلی وجود ندارد و در حال حاضر بهترین آن فرمالدئید است. بنابراین تنوع زیادی از تثبیت‌کننده‌ها وجود دارد که بر حسب نوع بافت و شکل آن‌ها استفاده می‌شود.

پنج دسته از تثبیت‌کننده‌ها وجود دارند که بر حسب عملکرد تقسیم‌بندی می‌شوند.

• مواد اکسیدان
• آلدئیدها
• نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک
• جیوه‌ای
• الکل‌ها

آلدئیدها

این دسته از تثبیت‌کننده‌ها شامل فرمالدئید (فرمالین) و گلوتالدئید می‌شوند. تثبیت بافت به خصوص بین رزیدوهای^[۱] لیزین بافت در اتصال متقابل^[۲] در پروتئین‌ها تشکیل می‌شود. اتصال متقابل به ساختار پروتئین‌ها آسیب نمی‌رساند. بنابراین فرمالدئید برای تکنیک‌های ایمونوپراکسیداز مناسب است. فرمالدئید به دیواره بافت به آرامی نفوذ می‌کند. محلول استاندارد مورد استفاده معمولا فرمالین ۱۰۰ درصد می‌باشد. بافر از اسیدی شدن بافت که موجب اتولیز می‌شود ممانعت می‌کند و باعث رسوب رنگدانه فرمالین در بافت می‌گردد.

هرچند گلوتالدئید به علت تخریب ساختار مارپیچ آلفا در ساختار پروتئین برای رنگ‌آمیزی ایمونوپراکسیداز قابل استفاده نیست ولی سرعت رنگ‌آمیزی را بالا می‌برد و برای میکروسکوپ الکترونیکی مناسب می‌باشد. این تثبیت‌کننده نفوذ بسیار ضعیفی دارد، اما به‌طور کلی جزئیات سیتوپلاسمی و هسته‌ای را به خوبی نشان می‌دهد. محلول استاندارد گلوتالدئید بافردار ۲ درصد است.

جیوه‌ای

جیوه‌ای‌ها توسط یک مکانیسم ناشناخته بافت را تثبیت می‌کنند. آن‌ها حاوی کلرید جیوه و شامل تثبیت‌کننده شناخته‌شده به عنوان B-5 و Zenker هستند. این تثبیت‌کننده‌ها نفوذ نسبتا ضعیفی داشته و باعث ایجاد سختی در بخشی و یا برخی از بافت‌ها می‌شوند، اما بافت را به سرعت و با جزئیات هسته‌ای عالی نشان می‌دهد. بهترین کاربرد آن‌ها برای تثبیت بافت‌های خونساز و رتیکولوندوتلیال است. از آنجا که این تثبیت‌کننده‌ها حاوی جیوه هستند، باید هنگام کار با آن‌ها دقت و ملاحظات لازم صورت گیرد.

الکل‌ها

الکل‌ها، از جمله الکل متیلیک (متانول) و اتیل الکل (اتانول)، دناتورکننده^[۳] پروتئین هستند و به‌طور معمول برای بافت استفاده نمی‌شوند زیرا باعث شکنندگی و سختی بیش از حد بافت می‌گردند. با این حال، آن‌ها برای اسمیر سلولی مناسب می‌باشند زیرا به سرعت وارد عمل شده و جزئیات هسته‌ای را خوب نشان می‌دهند. قوطی اسپری تثبیت‌کننده الکل برای تثبیت لام بعد از انجام پاپ اسمیر به بازار عرضه شده است.

عامل اکسید کننده

عامل اکسیدکننده شامل تثبیت‌کننده‌های پرمنگنات (پرمنگنات پتاسیم)، تثبیت‌کننده‌های دی کرومات (پتاسیم دی کرومات) و تترا اکسید اوسمیوم می‌باشند. آن‌ها اتصال متقابل در پروتئین ایجاد می‌کنند، اما باعث دناتوراسیون گسترده می‌شوند. بعضی از آن‌ها برای کاربردهای خاص استفاده می‌شوند.

نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک

نمک آلی یا معدنی اسید پیکریک شامل تثبیت‌کننده با اسید پیکریک است. در درجه نخست، محلول بوئن را می‌توان نام برد. نحوه عملکرد این تثبیت‌کننده هنوز ناشناخته است. این دسته به خوبی جیوه‌ای‌ها با جزئیات خوب هسته‌ای هستند اما در بافت ایجاد سختی نمی‌کنند. اسید پیکریک در حالت خشک خطر انفجار دارد. به صورت محلول همه چیز حتی پوست را زرد می‌کند.

عوامل موثر بر تثبیت

تعدادی از عواملی که بر روی روند تثبیت تاثیر می‌گذارد عبارت‌ است از:

• دما
• بافر
• غلظت
• نفوذ
• حجم
• فاصله زمان

تثبیت در pH نزدیک به خنثی (۶ الی ۸) انجام می‌شود. کمبود اکسیژن در بافت‌ها باعث کاهش pH می‌شود، بنابراین باید ظرفیت بافری در ثابت‌کننده برای جلوگیری از اسیدیته بیش از حد وجود داشته باشد. اسیدیته به نفع تشکیل رنگدانه فرمالین به صورت سیاه، قطبی شدن رسوبات در بافت می‌باشد. بافرهای شایع عبارتنداز بافر فسفات، بیکربنات، cacodylate، veronal می‌باشند. بافرتجاری فرمالین بافر فسفات در pH معادل ۷ است.

نفوذ به بافت به قدرت نفوذپذیری هر یک از ثابت‌کننده‌ها که مختص خودشان است، بستگی دارد. فرمالین و الکل بهترین نفوذ، و گلوتالدئید بدترین نفوذ را دارند. جیوه‌ای‌ها و برخی دیگر در جایی میان این دو قرار دارند. یک راه حل این مشکل این است که برش بافت نازک ( ۲ تا ۳ میلی‌متر) گرفته شود. نفوذ به یک بخش نازک‌تر با سرعت بیشتری از بخش ضخیم رخ خواهد داد.

حجم

حجم تثبیت‌کننده بسیار مهم و تعیین کننده است. نسبت ۱۰:۱ تثبیت‌کننده به بافت باید وجود داشته باشد. بدیهی است، در صورت حجم کمتر از این مقدار تثبیت ایده‌آل صورت نگیرد. یک راه برای برطرف‌کردن این مشکل تغییر تثبیت‌کننده‌ها در فواصل زمانی ثابت است. تحرک نمونه در تثبیت‌کننده نیز تثبیت را افزایش می‌دهد.

دما

افزایش درجه حرارت، همانند افزایش دما در تمام واکنش‌های شیمیایی، سرعت تثبیت را افزایش می‌دهد، افزایش تا زمانی که بافت به حالت پختگی نرسد صورت می‌گیرد. فرمالین گرم بافت را سریعتر تثبیت می‌کند و این اغلب قدم اول در پردازشگر بافت خودکار است.

غلظت

با توجه به هزینه تعهد تهیه مواد، غلظت مواد تثبیت‌کننده باید به پایین‌ترین سطح ممکن تنظیم شود. غلظت مناسب فرمالین همانطور که گفته شد ۱۰ درصد است و گلوتالدئید ۰٫۲۵ درصد تا ۴ درصد ساخته می‌شود. غلظت بیش از حد ممکن است به بافت‌های بدن همانند افزایش حرارت بیش از حد، تاثیر منفی باقی بگذارد. نکته بسیار مهم فاصله زمانی از برداشت بافت‌ها و قرارگرفتن در تثبیت‌کننده است. برای جلوگیری از ایجاد آرتیفکت در بافت و نمونه هنگام گرفتن نمونه آن را در محلول مرطوب نگه دارد. فاصله زمانی زیاد در این امر موجب از بین رفتن آرگانل‌های سلولی و هسته‌ای و تجمع آرتیفکت می‌شود.

استفاده مشترک برای تثبیت‌کننده‌ها در آزمایشگاه آسیب‌شناسی بر اساس ماهیت تثبیت‌کننده‌ها، نوع بافت و جزئیات بافت وجود دارد. فرمالین برای همه نمونه‌های پاتولوژیک حاصل از عمل جراحی و بافت‌های حاصل از کالبد شکافی در رنگ‌آمیزی H&E استفاده می‌گردد.

تثبیت‌کننده Zenker برای بافت رتیکولواندوتلیال از جمله غدد لنفاوی، طحال، تیموس، و مغز استخوان توصیه می‌شود. این تثبیت‌کننده نه تنها هسته را به خوبی نشان می‌دهد بلکه جزئیات خوبی از آن را نیز نمایان می‌سازد. با این حال ذخایر جیوه (Dezenkerized) قبل از رنگ‌آمیزی باید برداشته شود در غیر این صورت ذرات سیاه به وجود می‌آیند.

گاهی اوقات استفاده از محلول بوئن به عنوان تثبیت‌کننده، بافت‌های بیضه، دستگاه گوارش و بافت غدد درون‌ریز توضیه میشود. اما برای بافت‌های خونساز مناسب نیست و در هنگام استفاده از این محلول نیازی هم نیست که قبل از رنگ‌آمیزی جیوه برداشته شود. گلوتالدئید برای تثبیت بافت برای میکروسکوپ الکترونی توصیه میشود. گلوتالدئید باید سرد و بافردار باشد و بیش از ۳ ماه نمی‌بایست استفاده شوند. بافت باید تازه باشد و ترجیحا برش در داخل گلوتالدئید با ضخامت کمتر از ۱ میلی‌متر به منظور افزایش تثبیت صورت گیرد.

الکل‌ها، به‌طور خاص اتانول، در درجه اول برای اسمیر استفاده میشوند. استفاده از اتانول (۹۵ درصد) تکنیکی سریع و ارزان است. از آنجا که اسمیر تنها یک ردیف سلول ضخامت دارد، هیچ مشکلی از نظر کوچک شدن وجود ندارد و از آنجایی که اسمیر مانند برش نیست، هیچ مشکلی ناشی از شکنندگی وجود ندارد.

برای تثبیت برش‌های منجمد، شما می‌توانید از هر نوع تثبیت‌کننده‌ای استفاده کنید، اگرچه متانول و اتانول بهترین هستند.

پس از اینکه بافت ثابت شد، باید آن را به فرمی که بتوان مقاطع نازک میکروسکوپی از آن تهیه کرد پردازش شود.

روش معمول با پارافین انجام می‌شود. بافت‌های جداسازی شده در پارافین، که در چگالی به بافت مشابه است، می‌تواند در هر نقطه از ۳ تا ۱۰ میکرون برش بخورند که به‌طور معمول ۶ الی ۸ میکرون می‌باشند. روشی که در آن بافت تثبیت‌شده به پارافین وارد میشود، پردازش بافت نامیده میشود. گام های اصلی در این فرآیند از دست‌دادن آب و پاکسازی است.

پارافین به بافت تثبیت‌شده مرطوب (در حلال‌های آبی) نمیتواند به‌طور مستقیم نفوذ کند. اول باید آب از بافت گرفته شود که معمولا با یک سری از الکل‌ها انجام میشود و از الکل ۷۰ درصد شروع شده به ۹۵ درصد تا ۱۰۰ درصد ختم میشود. گاهی اوقات اولین گام ترکیبی از فرمالین و الکل است. آبگیری‌های دیگر ار میتوان مورد استفاده قرار داد، اما دارای معایب عمده‌ای هستند. استون بسیار سریع است، اما خطر آتش سوزی دارد، بنابراین از استون فقط برای پردازش مجموعه بافت‌های کوچک استفاده میشود. دی اکسان را میتوان بدون پاکسازی استفاده کرد، اما بخار ناشی از آن سمی است.

گام بعدی “پاکسازی” است و متشکل از حذف آبگیرها است ان hematein است. از آنجا که این بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی درخت بسیار نادر است در حال حاضر، اغلب hematein به‌صورت مصنوعی به‌دست می‌آیند. به منظور استفاده از آن به عنوان یک رنگ باید “رسیده” و یا اکسید باشد. هماتوکسیلین به‌طور غیرمستقیم بافت را رنگ می‌کند و نیاز به یک لینک به بافت دارد.

عوامل جدی‌تر پاکسازی برای استفاده وجود دارد. بسیاری از آن‌ها در لیمونن، روغن‌های بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی بافت شناسی پزشکی سبک موجود در پوست مرکبات هستند. از دیگر انواع، زنجیره‌ای طولانی هیدروکربن آلیفاتیک^[۴] را میتوان نام برد. اگرچه خطر کمتری دارند اما بافت را خشک، و برش بافت را ضعیف میکنند.

در نهایت، بافت با ماده تعبیه‌شده که تقریبا همیشه پارافین است، باقی‌می‌ماند. پارافین میتواند رد نقطه بافت شناسی  ذوب تفاوت، برای سختی‌های مختلف، بسته به راه تهیه بافت و بر حسب آب‌و‌هوا (گرم در برابر سرد) خریداری شود.

یک محصول به نام پاراپلاست می‌توان اضافه کرد که بلوک پارافینی، آسان‌تر برش می‌زند. خلا می‌تواند در داخل پردازنده‌های بافت برای کمک به نفوذ عامل تعبیه اعمال شود.

فرآیندهای فوق تقریبا همیشه برای حجم زیادی از بافت‌های معمول پردازش خودکار می‌باشد. اتوماسیون متشکل از دستگاهی است که بافت‌های اطراف را از طریق عوامل مختلف در یک مقیاس زمانی از پیش ‎تعیین‎شده حرکت می‌دهد. “تکنیکان” یکی از شایع‌ترین و قابل اطمینان‌ترین پردازنده‌های بافت (مکانیکی به همراه یک الکتروموتور با درایوهای چرخ دنده‌ها است.) هرچند دیگر ساخته نمی‌شود. پردازنده‌های جدیدتر دارای هوش مصنوعی هستند که آن‌ها را کنترل می‌کنند یک خلا و یا گرما می‌تواند برای پردازش بکار رود.

بافت آماده است و هنوز در نوار کاست قرار دارد و باید توسط کارشناس مربوطه به صورت دستی به بلوک قرار داده شود. باید بافت را انتخاب کنید، از نوار کاست بیرون آورده و پارافین مذاب بر آن‌ها بریزید.

این “جاسازی” روند بسیار مهمی است، زیرا بافت باید به درستی در وسط بلوک پارافینی قرارگیرد حتی در برخی اوقات بسته به نظر پاتولوژیست نمونه باید جاسازی پارافین وجود دارد، پلاستیک‌های مختلف مقاطع نازک‌تری را می‌تواند ایجاد کند که شامل پلاستیک‌های شامل متاکریلات متیل، در متاکریلات، آرلدیت^[۵]، اپون^[۶] گلیکول می‌باشد.

متیل متاکریلات بسیار سخت است و به همین دلیل برای تعبیه استخوان برای حذف کلسیم استفاده می‌شود.

متاکریلات و گلیکول گسترده‌ترین استفاده از جهت سادگی کار را دارند.

آرالدیت همانند متاکریلات است، اما نیاز به یک فرآیند پیچیده‌تری جهت تعبیه دارد. از اپون به‌طور مداوم برای میکروسکوپ الکترونی که نیاز به یک برش بسیار نازک است، استفاده می‌شود. پلاستیک نیاز به معرف ویژه‌ای برای از دست دادن آب و پاکسازی دارد که گران قیمت هستند.

از آنجا که این نوع جاسازی شدن جهت پردازش به میکروتوم ویژه‌ای برای برش بلوک نیاز دارد و بلوک‌های کوچک ایجاد می‌شود، بنابراین این روش به نمونه‌های کوچک، از جمله مغز استخوان یا کبد اختصاص داده می‌شود.

برش

هنگامی که بافت‌ها جاسازی شدند، آ‌ها را باید به کمک وسیله‌ای به نام میکروتوم برش داده تا در قالب یک اسلاید قرار گیرند. میکروتووم وسیله‌ای است بیش از یک چاقو با یک مکانیسم برای برش بافت-پارافینی بلوک شده است. نکته‌ی مهمی که برای برش مناسب وجود دارد وجود تیغ بسیار تیز است.

تیغ‌ها هر کدام از انواع فلزی ضخیم و یا نازک استاندارد و انواع یک بار مصرف می‌باشند. انواع قدیمی این امکان را داشتند تا در حد مطلوب تیز شوند اما گران بودند. هزینه تیغه‌های جدید تقریبا خوب به‌نظر می‌رسد.

بلوک‌های پلاستیکی (متاکریلات، آرلدیت، یا اپون) با شیشه یا تیغ الماس برش می‌شوند. تیغ شیشه‌ای می‌تواند برشی را در حدود ۱ میکرون تهیه کند. مقاطع نازک برای میکروسکوپ الکترونی (۱٫۴ میکرون) با یک چاقو الماس بسیار گران قیمت است انجام می‌شود. معمولا این فاصله بافت شناسی پزشکی را که دامنه آن ۶ تا ۸ میکرون می‌باشد می‌توان تنظیم کرد. برش بافت یک هنر است و حاصل مهارت و تمرین زیادی می‌باشد.

مهم‌ترین مشکل در هنگام تهیه برش، پاره و سوراخ شدن و یا چروک خوردن و … می‌باشد. جهت کاهش چروک‌ها در برش، آن‌ها را در حمام آب گرم که به حذف چین و چروک کمک می‌کند شناور می‌کنند. سپس آن‌ها را بر روی یک اسلاید شیشه‌ای تمیز میکروسکوپی قرار می‌دهند.

قرار گرفتن لام در انکوباتور گرم به مدت حدود ۱۵ دقیقه، صرفا جهت کمک به چسبیدن بخش برش داده شده به اسلاید است. اگر برای رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برش تهیه می‌شود، این حرارت ممکن است به آنتی ژن‌ها آسیب برساند، پس این مرحله می‌تواند نادیده گرفته شود و با استفاده از چسب مخصوص برش را به چسب و در نهایت به اسلاید متصل کرد.

فرمالین بهترین تثبیت‌کننده است حتی در شرایطی که ایده‌آل نیست. به طور معمول هیچ بافتی وجود ندارد که به آن در طی تثبیت‌شدن آسیب قابل توجهی وارد شود. اکثر پرسنل می‌توانند فرمالین را تشخیص دهند زیرا به اندازه کافی بوی تند دارد که آن‌ها مراقب دست‌زدن و استنشاق آن باشند.